Препаративное центрифугирование. Зональное центрифугирование Метод центрифугирования используют с целью изучения строения

Мы как раз начали применять еще новый в то время метод дифференциального центрифугирования. Он сводится к тому, что клетки разрушают в гомогенизаторе, а затем центрифугируют при последовательно возрастающих скоростях, после чего получают несколько фракций, состоящих из разных органелл (рис. 1.) Выделенные таким путем органеллы все еще сохраняют многие из своих функциональных свойств, которые можно затем изучить посредством биохимических методов. Наша задача состояла в том, чтобы установить местонахождение в этих фракциях некоторых ферментов, участвующих в обмене углеводов в печени крысы, и тем самым выяснить, с какими клеточными структурами связаны эти ферменты. Как правило, мы проверяли сначала гомогенат клеток на присутствие данного фермента, а затем искали его во фракциях. Среди прочих ферментов мы работали с так называемой кислой фосфатазой. Этот фермент, отщепляющий неорганический фосфат от ряда фосфорных эфиров, не связан непосредственно с углеводным обменом. В основном он служил нам в качестве контроля.

К нашему удивлению, активность кислой фосфатазы в гомогенате была в 10 раз меньше той величины, которую следовало ожидать на основании предыдущих анализов препаратов, подвергнутых более основательному разрушению в смесителе Уоринга. Суммарная активность всех фракций хотя и превышала вдвое активность гомогената, но все-таки была в 5 раз меньше ожидаемой величины. Когда через пять дней мы повторили определения на тех же фракциях (которые хранили все время в холодильнике), то оказалось, что активность фермента значительно возросла во всех отдельных фракциях, а особенно во фракции, содержащей митохондрии. Теперь суммарная активность уже достигла ожидаемой величины.

К счастью, мы устояли перед искушением отбросить первую серию данных как результат технической ошибки. Мы провели несколько дополнительных опытов и быстро получили ключ к разгадке тайны. В живых клетках фермент в основном (или даже полностью) заключен внутри небольших мешочкоподобных частиц. Поверхностная мембрана этихчастиц не только способна удерживать фермент внутри частицы, но и препятствует проникновению извне тех мелких молекул фосфорных эфиров, с которыми мы работали. Активность, измеренная в наших опытах, характеризовала лишь ту небольшую часть фермента, которая либо находилась в клетке в свободном состоянии, либо освободилась из частиц, поврежденных в ходе опыта. Смеситель Уоринга практически разрушает все частицы; при более мягкой обработке в гомогенизаторе, которую мы применили в наших исследованиях, разрушается лишь около 10% частиц. Этим и объясняется низкая первоначальная активность фермента в гомогенате. Дальнейшее фракционирование приводит к возрастанию суммарной активности во фракциях еще на 10%. Остальная часть фермента освобождается в результате старения частиц при хранении их в течение пяти дней в холодильнике.

TBegin-->TEnd-->

Рис. 1. Дифференциальное центрифугирование позволяет разделить клетки на фракции, состоящие из различных клеточных компонентов. Быстрое механическое вращение пестика разрушает клетки, вызывая освобождение их содержимого в окружающую среду. Гомогенат подвергается последовательному центрифугированию при разных скоростях. Метод, разработанный В. Шнайдером, включает этапы 1—8. Автор и его сотрудники ввели этапы 9 и 10. Фракция митохондрий (6 этап) осаждается после центрифугирования при 25 000 g в течение 10 мин. Числа, характеризующие градиент плотности сахарозы, показывают удельный вес (г/см3).

Метод дифференциального центрифугирования

Суть метода:

1. Приготовление гомогената из исследуемых клеток;

2. Центрифугирование

3. Разделение фракций

Изучение фракций

Принцип метода – в разделении внутриклеточных компонентов на фракции, отличающиеся по массе при помощи высокоскоростной центрифуги.

При подготовке клеток к такому исследованию из клеток готовится гомогенат. Гомогенат – это клетки, которые подвергаются механическому разрушению до состояния взвеси из внутриклеточных структур. Полученные фракции, в дальнейшем можно изучать методами биохимического анализа или изучать морфологию этих структур.

Метод дифференциального центрифугирования рассматривался нами при изучении темы Вакуолярная система клетки, при открытии Де Дювом лизосом и др.

Центрифугирование – первый этап фракционирования, с его помощью разделяются толко достаточно крупные компоненты. Для достижения более высокой степени разделения клеточных компонентов далее используется метод седиментации в градиенте плотности. Эту разновидность метода мы рассматривали в теме, когда касались морфологии рибосом, их субъединиц и рРНК, которые дифференцировали по величине константы седиментации Сведберга.

Для фракционирования отдельных разновидностей белков в биохимии применяется метод хроматографии. В биологии часто используется метод распределительной хроматографии. Суть этого метода заключается в том, что каплю образца (содержащего биологическую жидкость) наносят на поверхность специальной бумаги (хроматография на бумаге) или на пластинку из стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента (целлюлозы или силикагеля) – хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография. Затем пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например воды и спирта). По мере движения растворителя вверх по пластинке его молекулы подхватывают те молекулы образца, которые растворяются. В результате происходит дифференциация молекул образца на хорошо и плохо растворимые, то есть те которые движутся быстро и медленно. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют на ней местоположение определенных молекул. Другая разновидность разгонки белков – колоночная хроматография. В этом случае смесь молекул образца пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с разной скоростью. Этот вид хроматографии, когда используются колонки, набитые крошечными пористыми шариками, находящимися в геле позволяют определить размер белковых молекул.

Биологическое применение

Разнообразные методы хроматографии используются в биологии, например для определения разницы в белках у близких видов (видов-двойников), для которых этот метод является вторым после достаточно трудоемкого кариологического анализа.

Суть этого метода в применении радиоактивных изотопов водорода (трития), серы, фосфора, кислорода и др. и их обнаружения в образце, в который они вводились.

Метод очень чувствительный, так как практически можно зарегистрировать каждый распад, то есть может быть учтен каждый радиоактивный атом.

Принцип метода:

В живую, функционирующую клетку вводятся радиоактивные предшественники, путем очень кратковременного (импульсного мечения). Они включаются в состав определенных клеточных структур. Затем из клеток готовятся микроскопические препараты, на поверхность которых наносится фотоэмульсия. После определенного времени экспозиции в результате радиоактивного распада происходит восстановление серебра фотоэмульсии альфа и бета частицами. После проявления фотоэмульсии, на поверхности препарата видны темные метки, в тех участках, в которые был включен радиоактивный предшественник.

Таким образом, можно наблюдать, как радиоактивная метка перемещается из одной клеточной структуры в другую. Так можно выяснить в каких внутриклеточных структурах может происходить синтез тех или иных веществ.

Если в клетки ввести меченый тритием тимидин, то можно изучать течение во времени процессов, связанных с обновлением (редупликацией ДНК, если в клетку ввести меченый тритием урацил, то можно изучать динамику процессов, связанных с синтезом разнообразных видов молекул РНК, (например, рРНК в ядрышке, иРНК – при транскрибции и т.д.).

Этот метод мы разбирали при изучении разделов об определении времени жизненного цикла клетки и доказательств полуконсервативности редубликации ДНК, при изучении механизма образования экспортного белка.

Период полураспада некоторых радиоактивных изотопов, применяющихся в биологии:

Р32 – 14 сут; J134 – 8.1 сут; S35 – 87 сут; C14 – 5 570 лет; Ca45 – 164 сут; H3 – 12,3 года.

Метод замораживания-скалывания

Принципиально новые возможности электронной микроскопии открылись сравнительно недавно, после разработки метода «замораживания – скалывания». С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе.

При обычном замораживании в клетках образуются кристаллики льда, которые заметно искажают их структуру. Во избежание этого клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (-196С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций.

Замороженный блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода). Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. Однако весь фокус состоит в том, что напыление производится под углом к поверхности образца. Это очень важный момент. Появляется эффект тени, изображение выглядит объемным.

В трансмиссионном микроскопе электронный луч способен проникнуть только через очень тонкие срезы. Обычная толщина оттененных образцов чрезмерно велика, поэтому органическую материю, подстилающую слой металла, необходимо растворить. В результате остается тонкая металлическая реплика (или отпечаток) с поверхности образца. Реплику и используют в трансмиссионном микроскопе.

Этот метод предоставил, например, уникальную возможность наблюдать внутреннее строение мембран клетки.

Дифференциальное центрифугирование

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Принцип метода состоит в том, что при центрифугировании развивается центробежная сила, под воздействием которой взвешенные частицы оседают на дно центрифужной пробирки.

После того, как в начале 40-х годов начали использовать ультрацентрифугу, разделение клеточных компонентов стало вполне реальным.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить – разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

При высокоскоростном центрифугировании крупные компоненты клетки (например, ядра) быстро оседают (седиментируют), при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высоких скоростях в осадок выпадают более мелкие компоненты, такие как хлоропласты и митохондрии.

То есть при центрифугировании компоненты клетки распадаются на фракции: крупные и мелкие, поэтому второе название метода? фракционирование. При этом, чем выше скорость и длительность цетрифугирования, тем мельче полученная фракция.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Этапы дифференциального центрифугирования: низкая скорость (ядра, цитоскелет), средняя скорость (хлоропласты), высокая скорость (митохондрии, ризосомы, микротельца), очень высокая скорость (рибосомы).

Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов. Так, использование именно этого метода принесло триумфальный успех в изучении биосинтеза белка.

Ну и вообще, чистые фракции внутриклеточных структур можно подвергать любым видам анализа.

Метод культуры клеток

Клетки животных, выделенные в культуру (то есть помещенные на питательную среду), погибают после определенного числа делений, поэтому считаются трудным и неудобным объектом для культивирования. Другое дело клетки растений, способные делиться неограниченное число раз.

Метод культуры клеток облегчает изучение механизмов клеточной дифференциации у растений.

На питательной среде клетки растений образуют однородную недифференцированную клеточную массу- каллус. Каллус обрабатывают гормонами. Под влиянием гормонов клетки каллуса могут давать начало разным органам.

Лекция № 3.

Количество часов: 2

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК

1. Световая микроскопия

2. Электронная микроскопия, п реимущества и недостатки. Разновидности электронной микроскопии

Клетки очень малы по размерам и в тоже время сложно устроены. Поэтому для успешного изучения строения и функционирования клетки необходимо знать и владеть соответствующими экспериментальными методами.

На первом этапе развития цитологии единственным способом изучения клетки было световое микроскопирование .

Микроскоп – это прибор, позволяющий получить увеличенное изображение мелких объектов, не видимых невооруженным глазом. В микроскопии принято использовать следующие единицы длины:

микрометр (1 мкм – 10 -6 м );

нанометр (1 нм – 10 -9 м );

ангстрем (1Å – 10 -10 м ).

Существуют световое и электронное микроскопирование. В световом микроскопе для получения увеличенного изображения используется свет, в электронном - поток электронов. Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Разрешающая способность – это наименьшее расстояние, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки. Разрешающая способность человеческого глаза составляет около 100 мкм. Это означает, что невооруженным глазом с расстояния 25 см наблюдатель со средней остротой зрения может отличить одну точку от другой, если они отстоят друг от друга на расстоянии не менее 100 мкм. Если рассматриваемые точки находятся на расстоянии менее 100 мкм, то они кажутся одной расплывчатой точкой. Лучший современный световой микроскоп дает возможность рассмотреть структуры с расстоянием между элементами около 0,25 мкм, электронный микроскоп - порядка 1,5 А.

Световое микроскопирование - это совокупность методов наблюдения микрообъектов с помощью различных оптических микроскопов. Эти методы существенно зависят от типа объектива микроскопа, вспомогательных приспособлений к нему, вида микрообъекта и способа подготовки его для наблюдения, а также от характера его освещения при наблюдении. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена размерами, сравнимыми с длиной световой волны (0,4–0,7 мкм для видимого света). Однако многие элементы клеточной структуры значительно меньше по размерам. Кроме того, при использовании обычного светового микроскопа большинство структур живой клетки являются оптически пустыми. Оптически пустыми называют структуры, которые прозрачны и почти не отличаются по показателю преломления от окружающей их среды. Для выявления таких структур были разработаны различные способы фиксации и окраски материала.

Фиксация – это обработка, которая быстро прерывает процессы жизнедеятельности клетки и по мере возможности сохраняет неизменными структуру клеток и тканей. После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, фиксируется местоположение и стабилизируется структура макромолекул.

Окрашивание применяется для оптической дифференциации клеточных структур, а также в цитохимических исследованиях для выявления мест локализации химических соединений. Например, основные красители (гематоксилин) обладают сродством к содержимому ядра, а кислотные красители (эозин) окрашивают цитоплазму. Для изучения живых клеток используются витальные (прижизненные) красители . Витальные красители сравнительно легко проникают в живые клетки и окрашивают некоторые структуры, не повреждая их. Все же витальные красители не совсем безвредны для клетки, и после длительного воздействия приводят ее к гибели. К витальным красителям относятся нейтральный красный (для окрашивания цитоплазмы), метиленовый синий (окраска комплекса Гольджи) и др. При помощи витальных красителей удалось доказать существование некоторых органоидов клетки, которых раньше принимали за артефакты.

Артефакт – изменение, которое возникает в ходе приготовления препарата.

Перед проведением исследований клетки или кусочки ткани обычно заливают в расплавленный парафин или специальную смолу. Использованная для заливки среда охлаждается или полимеризуется. В результате этого образуется твердый блок, который режут на очень тонкие срезы с помощью микротома. Обычно толщина срезов для световой микроскопии составляет 1-10 мкм. Недостатком этого метода является повреждение ряда структур клетки. Поэтому применяют метод приготовления срезов с помощью быстрого замораживания. Замороженную ткань режут на специальном микротоме (криотоме), оборудованном холодной камерой (криостатом).

Помимо обычной световой микроскопии изучение клетки проводится с помощью темнопольной, фазово-контрастной, флюоресцентной и некоторых других видов световой микроскопии.

Темнопольное микроскопирование. Темнопольный микроскоп в отличие от обычного снабжен специальным конденсором. В конденсоре имеется темная диафрагма, не пропускающая свет в центр поля зрения, так что объект освещается косым пучком. При этом в объектив микроскопа попадают только лучи, отраженные и рассеянные от поверхности объекта, что повышает контрастность некоторых структур и делает их видимыми. Темнопольную микроскопию применяют для наблюдения ряда структур в живой клетке. В частности темнопольную микроскопию используют для определения частоты повреждений акросомы у спермиев сельскохозяйственных животных.

Фазовоконтрастное микроскопирование. Фазовоконтрастный микроскоп был сконструирован Фрицем Зернике в 1932 г. Фазовоконтрастная микроскопия является отличным методом прижизненного наблюдения за клетками. Ее используют для изучения многих органоидов клетки и хромосом во время деления. В конденсоре фазовоконтрастного микроскопа имеется кольцевая диафрагма, через которую свет проходит в виде полого конуса, а остальные лучи поглощаются. В объективе находится фазовая пластинка, представляющая собой прозрачный диск, имеющий выемку. Форма и размер выемки совпадают с прямым изображением кольцевой диафрагмы. При помещении объекта между конденсором и объективом в задней фокальной плоскости объектива, кроме прямого изображения, появляется несколько перекрывающих друг друга дифракционных изображений диафрагмы. Выемка фазовой пластинки рассчитывается так, чтобы оба пучка лучей, образующих прямое и дифракционное изображение, отличались по оптическому пути на четверть длины волны. Таким образом, фазовые различия, которые раньше не улавливались глазом, превращаются в различия интенсивности и становятся видимыми.

Флуоресцентная микроскопия является хорошим методом прижизненного наблюдения клеток. Флуоресцентный микроскоп позволяет наблюдать флуоресценцию (свечение) ряда веществ и структур клетки. Флуоресценция объекта возбуждается ультрафиолетовыми или сине-фиолетовыми лучами от специальных источников света. Излучение объекта всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет. Объект рассматривается в лучах его флуоресценции, которые отделяются от лучей возбуждающего света при помощи светофильтров. Ряд веществ (некоторые витамины, пигменты, липиды) обладают собственной (первичной) флуоресценцией. Вещества клетки, не обладающие этим свойством, предварительно окрашивают специальными красителями – флюорохромами , а затем наблюдают вторичную флуоресценцию.

Электронное микроскопирование. В электронном микроскопе для построения изображения вместо света используют поток электронов в вакууме. Фокусировка электронного пучка производится не линзами, как в световом микроскопе, а электромагнитными полями. Изображение наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты при электронной микроскопии находятся в глубоком вакууме, поэтому предварительно их подвергают фиксации и специальной обработке. По этой причине с помощью электронного микроскопа можно изучать только убитые клетки. Кроме того, они должны быть очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается объектом. В этой связи в качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, помещенные на тончайшие пленки. В трансмиссионном (просвечивающем) электронном микроскопе электроны проходят сквозь объект так, как в световом микроскопе через него проходит свет. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.). В сканирующем электронном микроскопе точно сфокусированный пучок электронов движется взад и вперед по поверхности образца. При этом отраженные от его поверхности электроны собираются и формируют изображение. Преимущество использования этой разновидности электронного микроскопа заключается в том, что создается трехмерное изображение. Поэтому сканирующая электронная микроскопия используется для изучения поверхности объектов. Электронный микроскоп имеет разрешающую способность около 1–2 нм. Этого достаточно для изучения макромолекул.

Авторадиография. Этот метод основан на применении меченными радиоактивными изотопами веществ. Если добавить в среду радиоактивный изотоп, поглощаемый клетками в процессе метаболизма, то его внутриклеточную локализацию можно впоследствии выявить с помощью авторадиографии. При использовании этого метода тонкие срезы клеток помещают на пленку. Пленка темнеет под теми местами, где находятся радиоактивные изотопы. В качестве изотопов используют фосфор (P 32 ), железо (Fe 59 ), серу (S 35 ), углерод (С 14), тритий (H 3 ) и др.

Центрифугирование. Начало методу было положено в 1926 г., когда Сведберг изобрел аналитическую центрифугу и использовал ее для определения молекулярной массы гемоглобина. Перед центрифугированием необходимо разрушить клеточную оболочку. Разрушение проводят, используя ультразвуковую вибрацию, осмотический шок, измельчение, продавливание через маленькое отверстие. При осторожном разрушении некоторые органоиды клетки сохраняются в интактном состоянии. Измельченные ткани с разрушенными клеточными оболочками помещают в пробирки и вращают в центрифуге с большой скоростью. Метод основан на том, что различные клеточные органоиды имеют разную массу и плотность. Более плотные органоиды осаждаются в пробирке при низких скоростях центрифугирования, менее плотные - при высоких. Эти слои изучают отдельно. Так ядра и неразрушенные клетки, быстро оседают при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высокой скорости выпадают в осадок митохондрии, а еще при более высоких скоростях и длительных периодах центрифугирования осаждаются рибосомы. Обычно такие очищенные компоненты сохраняют высокую биохимическую активность.

Метод культуры клеток и тканей состоит в том, что из одной или нескольких клеток на специальной питательной среде можно получить группу однотипных клеток. Этот метод имеет колоссальные перспективы не только для цитологии, но и для медицины, сельского хозяйства. Так клеточные культуры используют для выяснения закономерностей дифференцировки, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, трансформации и др. В биотехнологии клеточные культуры применяют при производстве вакцин и биологически активных веществ. В фармакологии их используют в качестве тест-объектов при испытании новых лекарственных препаратов. Основоположником этого метода является американский зоолог и эмбриолог Р. Гаррисон (1879-1959), которому в 1907 г. удалось культивировать клетки саламандры в искусственной среде вне организма. Впоследствии многие типы растительных и животных клеток выращивались in vitro , и этот метод позволил сделать ряд важных открытий в области физиологии клеток. Выражение in vitro (по-латыни «в стекле) означает, что исследование проведено не на живом организме, а в стеклянном сосуде того или иного рода. В противоположность первому выражению in vivo указывает на эксперимент с целым, живым организмом. Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма, называют первичными культурами. В большинстве случаев клетки первичной культуры можно перенести из культуральной чашки и использовать для получения большого количества вторичных культур. Клеточные линии можно использовать для получения кло6нов, которые происходят из одиночной клетки-предшественника. Можно осуществить слияние клеток одного или разных видов. Чтобы добиться слияния, клетки подвергают воздействию вирусных ферментов или полиэтиленгликоля. Эти вещества повреждают плазматическую мембрану клеток, что приводит к образованию клетки с двумя отдельными ядрами. Спустя определенное время такая клетка делится путем митоза, образуя гибридную клетку. В гибридной клетке все хромосомы объединены в одно большое ядро. Такие гибридные клетки можно клонировать и получить гибридную клеточную линию. Используя этот метод, удалось получить гибридные клетки человека и мыши, человека и жабы. Поученные гибридные клетки нестабильны и после многочисленных клеточных делений теряют большинство хромосом либо одного, либо другого вида. Конечный продукт становится, например, по существу клеткой мыши, где человеческие гены отсутствуют или имеются лишь в незначительном количестве. Поэтому эту методику с успехом можно использовать для картирования генов в хромосомах человека.

Микрургия. Этот метод основан на использовании микроманипуляторов. Они представляют собой приборы, обеспечивающие точные движения микроинструментов в клетке. Микроинструменты обычно делают из стекла. Их форма определяется задачами микрургических операций. Они могут быть в виде игл, шприцев, пипеток, шпателей, скальпелей и т. д. С помощью микроманипуляторов над клетками можно производить разнообразные операции (инъекции в клетку веществ, извлечение и пересадка ядер, локальное повреждение клеточных структур и т.д.). Особенно хорошо микрургические операции удаются на крупных клетках (одноклеточные, яйцеклетки амфибий, клетки зародышей некоторых животных). Так клетку амебы удается разделить на три основных компонента – мембрану, цитоплазму и ядро. Затем эти компоненты можно вновь собрать и получить живую клетку. Таким путем могут быть получены искусственные клетки, состоящие из компонентов разных видов амеб. Микрургические операции производятся не только микроинструментами, но сфокусированным пучком ультрафиолетовых лучей (лучевой микроукол).

Кроме названных методов при изучении клетки используют хроматографию, электрофорез и некоторые другие. Новые методы позволили достичь огромных успехов в изучении клетки. Однако следует помнить, что классические методы цитологии, основанные на фиксации, окрашивании и изучении клеток под световым микроскопом, по-прежнему сохраняют практическое значение.

Лекция 1.

Структура растительной клетки

Световая микроскопия

Электронная микроскопия

Дифференциальное центрифугирование

Метод культуры клеток

Клетка является основной структурной и функциональной единицей живых организмов.

Клетки эмбриональных (неспециализированных) тканей животных и растений в общем плане строения очень сходны. Именно это обстоятельство в свое время явилось причиной для появления и развития клеточной теории. Морфологические различия проявляются уже в дифференцированных клетках специализированных тканей растений и животных. Особенности строения растительной клетки, как и растения в целом, связаны с образом жизни и способом питания. Большинство растений ведет относительно неподвижный (прикрепленный) образ жизни. Специфика питания растений состоит в том, что вода и питательные вещества: органические и неорганические, находятся вокруг в рассеянном виде и растению приходится их поглощать путем диффузии. Кроме того, зеленые растения на свету осуществляют автотрофный способ питания. Благодаря этому, эволюционно сложились некоторые специфические особенности строения и роста растительных клеток. К ним относятся:

	прочная полисахаридная клеточная стенка , окружающая клетку и составляющая жесткий каркас;
	пластидная система , возникшая в связи с автотрофным типом питания;
	вакуолярная система , которая в зрелых клетках обычно представлена крупной центральной вакуолью, занимающей до 95% объема клетки и играющей важную роль в поддержании тургорного давления ;
	особый тип роста клеток путем растяжения (за счет увеличения объема вакуоли);
	тотипотентность , то есть возможность регенерации полного растения из дифференцированной растительной клетки;
	есть еще одна деталь, отличающая растительные клетки от клеток животных: у растений при делении клеток не выражены центриоли .

Строение клетки в самом общем виде известно вам еще из курса общей биологии и при подготовке к вступительным экзаменам вы достаточно хорошо штудировали эту тему. Эта тема в разных аспектах рассматривается и в соответствующих университетских курсах (например, зоология беспозвоночных, низшие растения). Кроме того, более детальное знакомство с клеткой на высоком уровне предстоит в курсе "цитология". Нам же важно акцентировать внимание на специфических особенностях строения растительной клетки, причем преимущественно клетки высшего растения.

При самом поверхностном рассмотрении структуры типичной растительной клетки в ее составе обнаруживаются три основных компонента: (1) клеточная стенка , (2) вакуоль, занимающая в зрелых клетках центральное положение и заполняющая практически весь их объем и (3) протопласт , оттесняемый вакуолью к периферии в виде постенного слоя. Именно эти компоненты обнаруживаются на малом увеличении светового микроскопа. Причем клеточная оболочка и вакуоль являются продуктами жизнедеятельности протопласта.

Живое тело клетки? протопласт состоит из органоидов, погруженных в гиалоплазму . К организмам клетки относятся: ядро, пластиды, митохондрии, диктиосомы, эндоплазматический ретикулум, микротельца и др. Гиалоплазма с органеллами за вычетом ядра составляет цитоплазму клетки.

Для выражения размеров субклеточных структур используются определенные меры длины: микрометр и нанометр .

Микрометр в системе единиц измерения СИ величина, равная 10 -6 м . Говоря другими словами, микрометр (аббревиатура мкм) составляет 1/1000000 долю метра и 1/1000 долю миллиметра. 1 мкм = 10 -6 м . Старое название этой меры микрон .

Нанометр в той же системе представляет миллионную долю миллиметра 1 нм = 10 -9 м и тысячную долю микрометра.

Размеры и форма растительных клеток варьируются в широком диапазоне. В типичном случае размеры клеток высшего растения колеблются в пределах 10 - 300 мкм. Правда, встречаются клетки - гиганты, например, клетки сочной мякоти плодов цитрусовых составляют в поперечнике несколько миллиметров или чрезвычайно длинные лубяные волокна у крапивы достигают 80 мм длины при микроскопической толщине.

По форме различают изодиаметрические клетки, у которых линейные размеры во всех направлениях равны или отличаются незначительно (то есть длина, ширина и высота этих клеток сопоставимы). Такие клетки называют паренхимными (паренхима) .

Сильно вытянутые клетки, у которых длина во много раз (иногда в сотни и тысячи) превышает высоту и ширину, называют прозенхимными (прозенхима) .

Методы изучения растительной клетки

Для изучения клеток разработано и применяется множество методов, возможности которых определяют уровень наших знаний в этой области. Успехи в изучении биологии клетки, включая наиболее выдающиеся достижения последних лет, как правило, связаны с применением новых методов. Поэтому для более полного понимания клеточной биологии необходимо иметь хотя бы некоторое представление о соответствующих методах исследования клетки.

Световая микроскопия

Самым древним и, вместе с тем, наиболее распространенным методом изучения клетки является микроскопия. Можно сказать, что и начало изучения клетки было положено изобретением светового оптического микроскопа.

Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм. Это означает, что если вы смотрите на две линии, которые находятся друг от друга на расстоянии меньше 0,1 мм, они сливаются в одну. Чтобы различить структуры, расположенные более тесно, применяют оптические приборы, например, микроскоп.

Но возможности светового микроскопа не безграничны. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, то есть оптический микроскоп может быть использован только для изучения таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длиной волны светового излучения. Лучший световой микроскоп имеет разрешающую способность около 0.2 мкм (или 200 нм), то есть примерно в 500 раз улучшает человеческий глаз. Теоретически построить световой микроскоп с большим разрешением невозможно.

Многие компоненты клетки близки по своей оптической плотности и без специальной обработки практически не видны в обычный световой микроскоп. Для того, чтобы сделать их видимыми, используют различные красители , обладающие определенной избирательностью.

В начале XIX в. Возникла потребность в красителях для окрашивания текстильных тканей, что в свою очередь вызвало ускоренное развитие органической химии. Оказалось, что некоторые из этих красителей окрашивают и биологические ткани и, что было уж совсем неожиданно, часто предпочтительно связываются с определенными компонентами клетки. Использование таких избирательных красителей дает возможность более тонко исследовать внутреннее строение клетки. Приведем лишь несколько примеров:

	краситель гематоксилин окрашивает некоторые компоненты ядра в синий или фиолетовый цвет;
	после обработки последовательно флороглюцином и затем соляной кислотой одревесневшие оболочки клеток становятся вишнево - красными;
	краситель судан III окращивает опробковевшие клеточные оболочки в розовый цвет;
	слабый раствор йода в йодистом калии окрашивает крахмальные зерна в синий цвет.

Для проведения микроскопических исследований большую часть тканей перед окраской фиксируют . После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, а структура клетки стабилизируется. Одним из наиболее распространенных фиксаторов в ботанике является этиловый спирт.

Фиксация и окрашивание не единственные процедуры, используемые для приготовления препаратов. Толщина большинства тканей слишком велика, чтобы их сразу можно было наблюдать при высоком разрешении. Поэтому выполняют тонкие срезы на микротоме . В этом приборе использован принцип хлеборезки. Для растительных тканей изготавливают чуть более толстые срезы, чем для животных, поскольку клетки растений обычно крупнее. Толщина срезов растительных тканей для световой микроскопии около 10 мкм - 20 мкм. Некоторые ткани слишком мягкие, чтобы из них сразу же можно было получить срезы. Поэтому после фиксации их заливают в расплавленный парафин или специальную смолу, которые пропитывают всю ткань. После охлаждения образуется твердый блок, который затем режется на микротоме. Правда, для растительных тканей заливка применяется значительно реже, чем для животных. Это объясняется тем, что растительные клетки имеют прочные клеточные стенки, составляющие каркас ткани. Особенно прочны одревесневшие оболочки.

Однако заливка может нарушить структуру клетки, поэтому применяют еще и другой метод, где эта опасность уменьшена? быстрое замораживание. Здесь можно обойтись без фиксации и заливки. Замороженную ткань режут на специальном микротоме (криотоме).

Замороженные срезы, приготовленные таким способом, имеют явное преимущество, поскольку в них лучше сохраняются особенности естественной структуры. Однако их труднее готовить, а присутствие кристаллов льда все же нарушает некоторые детали.

Микроскопистов всегда беспокоила возможность потери и искажения некоторых компонентов клетки в процессе фиксации и окраски. Поэтому полученные результаты проверяют другими методами.

Весьма заманчивой представлялась возможность исследовать под микроскопом живые клетки, но так, чтобы более отчетливо проявились детали их строения. Такую возможность дают особые оптические системы: фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Хорошо известно, что световые волны, подобно волнам воды, могут интерферировать друг с другом, увеличивая или уменьшая амплитуду результирующих волн. В обычном микроскопе, проходя через отдельные компоненты клетки, световые волны меняют свою фазу, хотя человеческий глаз этих различий не улавливает. Но за счет интерференции можно преобразовать волны, и тогда разные компоненты клетки можно отличить друг от друга под микроскопом, не прибегая к окрашиванию. В этих микроскопах используют 2 пучка световых волн, которые взаимодействуют (налагаются) друг на друга, усиливая или уменьшая амплитуду волн, поступающих в глаз от разных компонентов клетки.

Электронная микроскопия

Возможности светового микроскопа, как уже было сказано, ограничиваются длиной волны видимого света. Его максимальная разрешающая способность составляет примерно 0.2 мкм.

Большой шаг вперед был сделан в микроскопии в 20-х годах нашего века, когда было обнаружено, что соответствующим образом подобранные электромагнитные поля можно использовать подобно линзам для фокусирования пучков электронов.

Длина волны электрона значительно меньше, чет длина волны видимого света, и если вместо света использовать электроны, то предел разрешения микроскопа может быть заметно снижен.

На основе всего этого был создан микроскоп, в котором вместо света используется пучок электронов. Первый электронный микроскоп сконструировали в 1931 г. Кнолл и Руска в Германии. Прошло, однако, много лет, прежде чем появилась возможность изучать при помощи этого микроскопа срезы тканей. Лишь в 50-е годы были разработаны методы изготовления срезов, обладающих необходимыми качествами. С этого времени началась новая эра микроскопии, и в науку буквально хлынул поток информации о тонком строении клеток (ультраструктуре клеток).

Сложности электронной микроскопии состоят в том, что для исследования биологических образцов необходима специальная обработка препаратов.

Первая трудность заключается в том, что электроны обладают очень ограниченной проникающей способностью, поэтому следует изготавливать ультратонкие срезы, толщиной 50 - 100 нм. Для того, чтобы получить столь тонкие срезы, ткани сперва пропитывают смолой: смола полимеризуется и формирует твердый пластмассовый блок. Затем с помощью острого стеклянного или алмазного ножа срезы нарезают на специальном микротоме.

Есть еще одна трудность: при прохождении через биологическую ткань электронов не получается контрастного изображения. Для того, чтобы получить контраст, тонкие срезы биологических образцов пропитывают солями тяжелых металлов.

Существует два основных типа электронных микроскопов. В трансмиссионном (просвечивающем) микроскопе пучок электронов, проходя сквозь специально подготовленный образец, оставляет его изображение на экране. Разрешающая способность современного трансмиссионного электронного микроскопа почти в 400 раз больше светового. Эти микроскопы имеют разрешающую способность около 0,5 нм (для сравнения: диаметр атома водорода около 0,1 нм).

Несмотря на столь высокое разрешение, просвечивающие электронные микроскопы имеют крупные недостатки:

Трехмерное (объемное) изображение получают с помощью сканирующего электронного микроскопа (ЭМ). Здесь луч не проходит через образец, а отражается от его поверхности.

Исследуемый образец фиксируют и высушивают, после чего покрывают тонким слоем металла? операция называется оттенением (образец оттеняют).

В сканирующем ЭМ сфокусированный электронный пучок направляется на образец (образец сканируют). В результате металлическая поверхность образца испускает вторичные электроны слабой энергии. Они регистрируются и преобразуются в изображение на телевизионном экране. Максимальное разрешение сканирующего микроскопа невелико, около 10 нм, но зато изображение получается объемным.

Метод замораживания-скалывания

Принципиально новые возможности электронной микроскопии открылись сравнительно недавно, после разработки метода "замораживания - скалывания". С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе.

При обычном замораживании в клетках образуются кристаллики льда, которые заметно искажают их структуру. Во избежание этого клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (- 196 С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций.

Замороженный блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода). Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. Однако весь фокус состоит в том, что напыление производится под углом к поверхности образца. Это очень важный момент. Появляется эффект тени, изображение выглядит объемным.

В трансмиссионном микроскопе электронный луч способен проникнуть только через очень тонкие срезы. Обычная толщина оттененных образцов чрезмерно велика, поэтому органическую материю, подстилающую слой металла, необходимо растворить. В результате остается тонкая металлическая реплика (или отпечаток) с поверхности образца. Реплику и используют в трансмиссионном микроскопе.

Этот метод предоставил, например, уникальную возможность наблюдать внутреннее строение мембран клетки.

Дифференциальное центрифугирование

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить - разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Ну и вообще, чистые фракции внутриклеточных структур можно подвергать любым видам анализа.

Метод культуры клеток

Метод культуры клеток облегчает изучение механизмов клеточной дифференциации у растений.

На питательной среде клетки растений образуют однородную недифференцированную клеточную массу? каллус. Каллус обрабатывают гормонами. Под влиянием гормонов клетки каллуса могут давать начало разным органам.

Строение и жизнедеятельность растительной клетки.

1. Строение растительной клетки: целлюлозная оболочка, плазматическая мембрана, цитоплазма с органоидами, ядро, вакуоли с клеточным соком. Наличие пластид - главная особенность растительной клетки.

2. Функции клеточной оболочки - придает клетке форму, защищает от факторов внешней среды.

3. Плазматическая мембрана - тонкая пленка, состоит из взаимодействующих молекул липидов и белков, отграничивает внутреннее содержимое от внешней среды, обеспечивает транспорт в клетку воды, минеральных и органических веществ путем осмоса и активного переноса, а также удаляет вредные продукты жизнедеятельности.

4. Цитоплазма - внутренняя полужидкая среда клетки, в которой расположено ядро и органоиды, обеспечивает связи между ними, участвует в основных процессах жизнедеятельности.

5. Эндоплазматическая сеть - сеть ветвящихся каналов в цитоплазме. Она участвует в синтезе белков, липидов и углеводов, в транспорте веществ. Рибосомы - тельца, расположенные на ЭПС или в цитоплазме, состоят из РНК и белка, участвуют в синтезе белка. ЭПС и рибосомы - единый аппарат синтеза и транспорта белков.

6. Митохондрии - органоиды, отграниченные от цитоплазмы двумя мембранами. В них с участием ферментов окисляются органические вещества и синтезируются молекулы АТФ. Увеличение поверхности внутренней мембраны, на которой расположены ферменты, за счет крист. АТФ - богатое энергией органическое вещество.

7. Пластиды (хлоропласты, лейкопласты, хромопласты), их содержание в клетке - главная особенность растительного организма. Хлоропласты - пластиды, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, который поглощает энергию света и использует ее на синтез органических веществ из углекислого газа и воды. Отграничение хлоропластов от цитоплазмы двумя мембранами, многочисленные выросты - граны на внутренней мембране, в которых расположены молекулы хлорофилла и ферменты.

8. Комплекс Гольджи - система полостей, отграниченных от цитоплазмы мембраной. Накапливание в них белков, жиров и углеводов. Осуществление на мембранах синтеза жиров и углеводов.

9. Лизосомы - тельца, отграниченные от цитоплазмы одной мембраной. Содержащиеся в них ферменты ускоряют реакцию расщепления сложных молекул до простых: белков до аминокислот, сложных углеводов до простых, липидов до глицерина и жирных кислот, а также разрушают отмершие части клетки, целые клетки.

10. Вакуоли - полости в цитоплазме, заполненные клеточным соком, место накопления запасных питательных веществ, вредных веществ; они регулируют содержание воды в клетке.

11. Клеточные включения - капли и зерна запасных питательных веществ (белки, жиры и углеводы).

12. Ядро - главная часть клетки, покрытая снаружи двухмембранной, пронизанной порами ядерной оболочкой. Вещества поступают в ядро и удаляются из него через поры. Хромосомы - носители наследственной информации о признаках организма, основные структуры ядра, каждая из которых состоит из одной молекулы ДНК в соединении с белками. Ядро - место синтеза ДНК, иРНК, рРНК.

Задание №1.

В основе разделения органоидов методом центрифугирования лежат их различия по

1. Строению и составу

2. Выполняемым функциям

3. Плотности и массе

4. Расположению в цитоплазме

Объяснение: при центрифугировании самые плотные (тяжелые) частицы опускаются вниз, то есть таким методом можно разделить органоиды по плотности и массе. Правильный ответ - 3.

Задание №2.

Что является структурно-функциональной единицей строения организмов всех царств?

1. ДНК

2. Ядро

3. Клетка

4. Хромосома

Объяснение: следую клеточной теории, структурно-функциональной единицей всего живого является клетка. Правильный ответ - 3.

Задание №3.

Какие вещества выполняют в клетке информационную функцию?

1. Нуклеиновые кислоты

2. Белки

3. АТФ

4. Сборка белка

Объяснение: как мы знаем, за информацию в клетке отвечают нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК). ДНК хранит генетическую информацию, а РНК способствует ее воспроизведению. Правильный ответ - 1.

Задание №4.

Какой процесс лежит в основе образования двух хроматид перед делением клетки?

1. Репликация ДНК

2. Транскрипция

3. Синтез РНК

4. Сборка белка

Объяснение: в основе образования двух хроматид лежит процесс репликации ДНК (синоним репликации - копирование). Правильный ответ - 1.

Задание №5.

Для каких организмов характерен хемосинтез?

1. Цианобактерий

2. Бактериофагов

3. Эукариот

4. Серобактерий

Объяснение: хемосинтез - процесс образования органических веществ из неорганических при помощи окисления химических веществ (как органических, так и неорганических). Хемотрофами могут быть только бактерии. Правильный ответ - 4.

Задание №6.

Какие животные имеют прямое постэмбриональное развитие?

1. Млекопитающие

2. Плоские черви

3. Земноводные

4. Бабочки

Объяснение: у насекомых различают развитие с полным и неполным превращением, у плоских червей тоже сложный цикл развития, земноводные развиваются через стадию головастика, а млекопитающие рождаются сразу похожими на взрослое животное. Правильный ответ - 1.

Задание №7.

Видовые признаки организмов сохраняются благодаря

1. Наследственности

2. Доминантности

3. Обмену веществ

4. Адаптации

Объяснение: видовые признаки сохраняются благодаря передаче данных признаков из поколения в поколение, то есть посредством наследственности. Правильный ответ - 1.

Задание №8.

У темноволосых родителей родилась светловолосая дочь. Определите генотип родителей, если известно, что темный цвет волос доминирует над светлым.

1. Аа х АА

2. Аа х Аа

3. Аа х аа

4. Аа х АА

Объяснение: такая ситуация возможна только если оба родителя гетерозиготны по этому признаку (Аа). В таком случае вероятность рождения светловолосого ребенка равна 25%. Правильный ответ - 2.

Задание №9.

Способность организмов приобретать новые признаки и свойства называют

1. Наследственностью

2. Саморегуляцией

3. Изменчивостью

4. Самовоспроизведением

Объяснение: как мы сказали в задании №7, наследственность отвечает за передачу признаков из поколения в поколение, а изменчивость способствует приобретению организмами новых признаков. Правильный ответ - 3.

Задание №10.

Микориза - это

2. Симбиоз мицелия с корнями растений

3. Болезнь растения, вызванная грибами

4. Гифы гриба, на которых развивается плодовое тело

Объяснение: микориза - это симбиоз гиф гриба и корней дерева. При этом дерево обеспечивается минеральными веществами, так как гриб разлагает органические вещества до неорганических, а гриб обеспечивается органическими веществами, так как дерево является фототрофом, то есть создает органические вещества из неорганических при помощи солнечного света. Правильный ответ - 2.

Задание №11.

На каком рисунке изображена клетка, которая не может делиться?

Объяснение: клетка, которая не может делиться изображена на рисунке 2, так как почти всю клетку занимает вакуоль, это говорит о том, что клетка уже достаточно старая, а старые клетки не делятся. Правильный ответ - 2.

Задание №12.

Зеленые водоросли относят к царству растений, так как они

1. В клетках содержат хлорофилл

2. Являются индикаторами загрязнения воды и почвы

3. Имеют клеточное строение

4. Выделяют в атмосферу углекислый газ в процессе дыхания

Объяснение: водоросли (не только зеленые) относят к растениям, так как они обладают рядом признаков, характерным растениям (неподвижны, автотрофны, имеют пигменты и т.д.), в том числе содержат хлорофилл. Правильный ответ - 1.

Задание №13.

Взрослая особь человеческой аскариды обитает в

1. Желудке

2. Надпочечниках

3. Кишечнике

4. Легких

Объяснение: рассмотрим жизненный цикл аскариды

Как видно из схемы - половозрелые взрослые особи обитают в кишечнике человека. Правильный ответ - 3.

Задание №14.

Обыкновенный дельфин, погружаясь в морские глубины, расходует кислород, который содержится в

1. Легких

2. Полостях тела

3. Воздушных мешках

4. Жабрах

Объяснение: дельфин является вторичноводным млекопитающим, то есть предки дельфина жили на суше. И, как и любое другое млекопитающее, в своей дыхательной системе имеет легкие, которыми и дышит. У него нет ни воздушных мешков (как у птиц), ни жабр (как у рыб) и в полостях тела воздух тоже не накапливается. Правильный ответ - 1.

Задание №15.

Ротовая полость человека выстлана тканью, в которой клетки

1. Соединены друг с другом отростками

2. Плотно прилегают друг к другу

3. Имеют поперечную исчерченность

4. Располагаются рыхло

Объяснение: ротовая полость человека выстлана многослойный неороговевающим эпителием. Одной из характеристик эпителия является очень низкое содержание межклеточного вещества, то есть клетки плотно прилегают друг к другу. Правильный ответ - 2.

Задание №16.

В сердце человека створчатые клапаны открываются в

1. Предсердия

2. Вену

3. Желудочки

4. Аорту

Объяснение: створчатые клапаны расположены в сердце между предсердиями и желудочками, поэтому и открываются они в желудочки. Правильный ответ - 3.

Задание №17.

Человеку, работа которого требует длительного напряжения зрения, необходимо дополнительно употреблять витамин

1. А

2. В

3. С

4. D

Объяснение: огромное значение для фоторецепции и для зрения в целом имеет нормальное содержание витамина А. Он содержится в различных окрашенных продуктах - моркови, перцах, а также в рыбе, яйцах, молоке, печени и др. Правильный ответ - 1.

Задание №18.

Гуморальная регуляция осуществляется с помощью

1. Нервных импульсов, возникающих в рецепторах

2. Веществ, образующихся в железах внутренней секреции

3. Белков, содержащихся в пище

4. Деятельности головного и спинного мозга

Объяснение: гуморальная, она же гормональная, регуляция осуществляется при помощи гормонов, циркулирующих в крови. Гормоны выделяются железами внутренней секреции. Правильный ответ - 2.

Задание №19.

После травмы головы у человека нарушилась координация движения из-за нарушения работы

1. Мозжечка

2. Переднего мозга

3. Среднего мозга

4. Продолговатого мозга

Объяснение: за координацию движений отвечает мозжечок, также он регулирует мышечный тонус, равновесие и отвечает за мышечную память. Правильный ответ - 1.

Задание №20.

Скрещиванию разных видов синиц, обитающих в пределах одного лесного массива, препятствует

1. Разных хромосомный набор

2. Различие потребляемых кормов

3. Нарушение светового режима

4. Отсутствие мест для гнездования

Объяснение: скрещивание разных видов (не только синиц) невозможно из-за различий в хромосомном наборе организмов. Правильный ответ - 1.

Задание №21.

Стабилизирующая форма естественного отбора способствует

1. Полному вытеснению редких рецессивных мутаций

2. Сохранению в популяции среднего значения признака

3. Формированию новых признаков

4. Увеличению внутривидового разнообразия

Объяснение: стабилизирующая форма естественного отбора сохраняет особей популяции со средним значением признака, выбраковывая организмы с отклонениями от нормы. Правильный ответ - 2.

Задание №22.

Копчиковая кость, аппендикс, остаток третьего века в углу глаза человека - это

1. Аналогичные органы

2. Гомологичные органы

3. Атавизмы

4. Рудименты

Объяснение: все перечисленные признаки - это органы, оставшиеся от предков и утратившие свои функции. Такие органы называют рудиментарными. Правильный ответ - 4.

Задание №23.

Какой критерий вида служит главным доказательством родства человеческих рас?

1. Морфологический

2. Географический

3. Генетический

4. Физиологический

Объяснение: сейчас, в основном, для доказательства родства организмов или определения принадлежности к определенной группе, использую различные генетические методы. И, в зависимости от процентного соотношения гомологичности ДНК, определяют родство. Так доказали и родство человеческих рас. Правильный ответ - 3.

Задание №24.

Отношения каких организмов служат примером симбиоза?

1. Клеща и собаки

2. Сосны и масленка

3. Щуки и карася

4. Растения росянки и насекомого

Задание №25.

Роль организмов-консументов в экосистеме состоит в

1. Установлении симбиоза с растениями

2. Использовании ими солнечной энергии

3. Использовании неорганических веществ

4. Преобразовании органического вещества

Объяснение: консументы является вторым звеном в пищевой цепи после продуцентов (они превращают неорганические вещества в органические), то используют созданные продуцентами органические вещества. Правильный ответ - 4.

Задание №26.

Образование залежей каменного угля в недрах Земли связано преимущественно с развитием древних

1. Водорослей

2. Покрытосеменных

3. Моховидных

4. Папоротникообразных

Объяснение: залежи каменного угля образовались из остатков разложения различных древних растений, в основном, папоротникообразных. Правильный ответ - 4.

Задание №27.

Четвертичная структура молекулы гемоглобина представляет собой

1. Глобулу из одной полипептидной цепи

2. Двойную полипептидную спираль

3. Несколько соединенных полипептидных цепей

4. Последовательность аминокислот в полипептидной цепи

Объяснение: чтобы представить четвертичную структуру, посмотрим на картинку

Как мы видим, четвертичная структура представляет собой несколько свернутых полипептидных цепочек, они могут быть соединены ионом металла (например, гемоглобин). Правильный ответ - 3.

Задание №28.

Каковы конечные продукты подготовительного этапа энергетического обмена?

1. Углекислый газ и вода

2. Мочевина и мочевая кислота

3. Триглицериды и аммиак

4. Аминокислоты и глюкоза

Объяснение: на подготовительном этапе энергетического обмена происходит расщепление сложных органических молекул - полимеров до мономером, то есть белки расщепляются до аминокислот, полисахариды до моносахаридов и т.д. Вся полученная при этом энергия рассеивается в виде тепла. Правильный ответ - 4.

Задание №29.

Анализ стадий эмбриогенеза позвоночных животных служит основой для изучения их

1. Особенностей размножения

2. Уровня обмена веществ

3. Модификационной изменчивости

4. Эволюционного происхождения

Объяснение: биогенетический закон гласит: онтогенез - повторение филогенеза, то есть в процессе развития (эмбрионального) организм повторяет все этапы эволюции, через которые проходили его предки. Правильный ответ - 4.

Задание №30.

Ускорение роста культурных растений и увеличение их биомассы за счет регулярного полива и подкормки - это изменчивость

1. Мутационная

2. Соотносительная

3. Модификационная

4. Комбинативная

Объяснение: это изменчивость, которая возникает у конкретного организма в конкретных условиях, при этом признаки не передаются потомству. Правильный ответ - 3.

Задание №31.

Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору, получают в селекции растений путем

1. Гетерозиса

2. Близкородственного скрещивания

3. Искусственного отбора

4. Искусственного мутагенеза

Объяснение: речь идет о получении полиплоидных организмов, то есть с увеличенным набором хромосом. Такой набор можно получить только при помощи искусственного мутагенеза. Правильный ответ - 4.

Задание №32.

Лишайники, в отличие от мхов,

1. Образуют ризоиды

2. Являются комплексными организмами

3. Вступают в симбиоз с корнями высших растений

4. Размножаются спорами

Объяснение: мхи - высшие растения, лишайники - симбиоз гриба и водоросли, то есть комплексные организмы. Правильный ответ - 2.

Задание №33.

Кровь по кровеносным сосудам человека течёт

1. Прерывисто - в соответствии с прерывистой работой желудочка

2. Толчками - вследствие пульсации сосудов

3. Прерывисто - вследствие задержки ее в органах

4. Непрерывно - вследствие эластичности стенок крупных артерий

Объяснение: сердце сокращается периодически, но за счет эластичности сосудов кровь в организме циркулирует непрерывно. Правильный ответ - 4.

Задание №34.

Что характерно для внешнего торможения рефлексов?

1. Формируется в нейронах вегетативной нервной системы

2. Образуется под влиянием условного раздражителя

3. Появляется при возникновении сильного раздражителя

4. Не развивается в нейронах функционирующей рефлекторной дуги

Объяснение: внешнее торможение - это торможение, возникающее под действием какого-то сильного внешнего раздражителя (например, боль, звук и т.д.). Правильный ответ - 3.

Задание №35.

Наиболее существенные и постоянные преобразования в биосфере вызывают

1. Климатические условия

2. Природные катаклизмы

3. Сезонные изменения в природе

4. Живые организмы

Объяснение: абиотические факторы постоянно влияют на нашу планету. В вопросе речь идет о биосфере, то есть о живой оболочке Земли, изменения в которой возникают из-за воздействия живых организмов друг на друга и на оболочку Земли. Правильный ответ - 4.

Задание №36.

Верны ли следующие суждения об обмене веществ?

А. Пластический обмен представляет собой совокупность реакций расщепления органических веществ в клетке, сопровождающихся выделением энергии.

Б. Хлорофилл растительных клеток улавливает солнечную энергию, которая аккумулируется в молекулах АТФ.

1. Верно только А

2. Верно только Б

3. Верны оба суждения

4. Оба суждения неверны

Объяснение: пластический обмен - процесс образование сложных молекул из простых (полимеров из мономеров). То есть процесс, обратный расщеплению. А второе утверждение верно. Правильный ответ - 2.

Задание №37.

Какие особенности строения и свойств воды определяют её функции в клетке?

1. Способность образовывать водородные связи

2. Наличие в молекулах макроэргических связей

3. Полярность молекулы

4. Высокая теплоемкость

5. Способность образовывать ионные связи

6. Способность выделять энергию при расщеплении

Объяснение: молекула воды полярная, между молекулами воды образуются водородные связи и она является внутренней средой организма и всех клеток, в которой происходят все реакции обмена, так же она является растворителем для большинства веществ. Таким образом, выбираем - 1, 3, 4.

Задание №38.

Какую функцию выполняют вставочные нейроны в нервной системе человека?

1. Передают нервные импульсы с двигательного нейрона в головной мозг

2. Передают нервные импульсы от рабочего органа в спинной мозг

3. Передают импульсы от спинного в головной мозг

4. Передают нервные импульсы к рабочим органам

5. Воспринимают нервные импульсы от чувствительных нейронов

6. Передают нервные импульсы двигательным нейронам

Объяснение: самая простая рефлекторная дуга состоит из чувствительного, вставочного и двигательного нейронов. Вставочные нейроны воспринимают импульс от чувствительных нейронов, передают сигнал из спинного мозга в головной и передают импульс к двигательным нейронам. Правильный ответ - 1, 3, 4.

Задание №39.

Какие из перечисленных примеров относят к ароморфозам?

2. Появление кровеносной системы у кольчатых червей

3. Возникновение теплокровности у млекопитающих

4. Расположение пальцев у дятлов - два вперед и два назад

5. Развитие сосущего ротового аппарата у насекомых

6. Появление четырехкамерного сердца у птиц

Объяснение: напомним, что ароморфоз - это такое изменение организма, которое способствует повышению его уровня организации. То есть это должно быть качественное (глобальное) изменение, такое, например, как появление кровеносной системы у кольчатых червей, возникновение теплокровности и появление четырехкамерного сердца. Остальные изменения является не глобальными, а частными. Правильный ответ - 2, 3, 6.

Задание №40.

Установите соответствие между признаком организма и царством, для которого он характерен.

Признак организма Царство

А. ДНК замкнута в виде кольца 1. Грибы

Б. По способу питания - автотрофы или гетеротрофы 2. Бактерии

В. Клетки имеют оформленное ядро

Г. ДНК имеет линейное строение

Д. В клеточное стенке имеется хитин

Е. Ядерное вещество расположено в цитоплазме

Объяснение: вспоминаем, что грибы - эукариоты, а бактерии - прокариоты, соответственно у прокариот отсутствует ядерная оболочка и все мембранные органеллы, кольцевая ДНК, по типу питания они могут быть как гетеро- так и автотрофами. То есть, правильный ответ - 221112.

Задание №41.

Установите соответствие между железой в организме человека и ее типом.

Железа Тип железы

А. Молочная 1. Внутренней секреции

Б. Щитовидная 2. Внешней секреции

В. Печень

Г. Потовая

Д. Гипофиз

Е. Надпочечники

Объяснение: железы внутренней секреции выделяют гормоны, то есть это такие железы, как щитовидная, гипофиз и надпочечники. Правильный ответ - 212211.

Задание №42.

Установите соответствие между характеристикой особи и ее генотипом.

Характеристика особи Генотип

А. Не дает расщепления в потомстве 1. Гомозиготный

Б. Имеет оба доминантных аллельных гена 2. Гетерозиготный

В. В потомстве происходит расщепление признаков

Г. Генотип содержит альтернативные гены

Д. Имеет оба рецессивных аллельных гена

Е. Образует разные типы гамет

Объяснение: гомозиготный генотип не дает расщепления в потомстве, имеет оба доминантных аллеля, не содержит альтернативных генов, имеет оба рецессивных аллеля и образует один тип гамет. Правильный ответ - 112212.

Задание №43.

Установите соответствие между характеристикой экосистем и их типом.

Характеристика Тип экосистем

А. Преобладают растения одного вида 1. Природная экосистема

Б. Обитает большое разнообразие видов 2. Агроэкосистема

В. Осуществляется саморегуляция

численности популяций

Г. Круговорот веществ незамкнутый

Д. Большую роль играет антропогенный фактор

Е. Пищевые цепи длинные

Объяснение: агроэкосистема включает один или несколько видов растений, имеет незамкнутый круговорот веществ, короткие пищевые цепи и человек играет большую роль в его жизнедеятельности. Правильный ответ - 211221.

Задание №44.

Установите последовательность процессов, происходящих при фагоцитозе.

1. Поступление мономеров в цитоплазму

2. Захват клеточной мембраной питательных веществ

3. Гидролиз полимеров до мономеров

4. Образование фагоцитозного пузырька внутри клетки

5. Слияние фагоцитозного пузырька с лизосомой

Объяснение: фагоцитоз - поглощение частиц пищи. Начинается с захвата клеточной мембраной питательных веществ, затем образуется фагоцитарный пузырек внутри клетки, потом он сливается с лизосомой, в лизосоме происходит гидролиз полимеров до мономеров и, в итоге, мономеры выходят в цитоплазму. Правильный ответ - 24531.

Задание №45.

Объясните, почему сокращение численности волков из-за отстрела в биоценозах тундры приводит к уменьшению запасов ягеля - корма северных оленей.

Объяснение: это происходит, потому что волки охотятся на северных оленей. Чем меньше волков, тем большей оленей, а олени кушаю ягель. При неконтролируемом размножении северных оленей запасы ягеля резко сократятся.

Задание №46.

Определите класс цветкового растения, изображенного на рисунке. Обоснуйте Ваш ответ. Назовите органы, обозначенные на рисунке буквами А и Б, и объясните их роль в жизни растения.

Объяснение: на рисунке представлена земляника (семейство розоцветные, класс двудольные, отдел покрытосеменные - наличие цветка и плода - признак покрытосеменных). А - цветок (орган полового размножения. Б - ус (столон) - видоизмененный побег. Земляника может размножаться и вегетативно при помощи столонов.

Задание №47.

Где расположен центр безусловно-рефлекторной регуляции кровяного давления человека? Чем различаются показатели кровяного давления в аорте и половых венах? Ответ поясните.

Объяснение: центр рефлекторно-рефлекторной регуляции кровяного давления расположен в продолговатом мозге (вообще большинство безусловных рефлексов контролируется спинным мозгом). В аорте давление более высокое, так как аорта расположена в начале большого круга кровообращения, а полыми венами большой круг кровообращения заканчивается, поэтому давление здесь наиболее низкое.

Задание №48.

В природе осуществляется круговорот кислорода. Какую роль играют в этом процессе живые организмы?

Объяснение: живые организмы дышат кислородом (кислород окисляет глюкозу при клеточном дыхании), при этом образуются углекислый газ и вода. Растения фиксируют углекислый газ в цикле Кальвина и выделяют кислород при фотосинтезе в качестве побочного продукта. А некоторые бактерии, осуществляющие хемосинтез, могут использовать кислород для окисления химических веществ.

Задание №49.

В биосинтезе фрагмента молекулы белка участвовали последовательно молекулы тРНК с антикодонами АГЦ, ГЦЦ, УЦА, ЦГА, АГА. Определите аминокислотную последовательность синтезируемого фрагмента молекулы белка и нуклеотидную последовательность участка двухцепочечной молекулы ДНК, в которой закодирована информация о первичной структуре фрагмента белка. Объясните последовательность ваших действий.

Объяснение: нам дана последовательность тРНК, значит задачу мы будем решать с конца: сначала напишем комплементарную цепь иРНК, затем комплементарную двойную цепь ДНК.

тРНК: АГЦ ГЦЦ УЦА ЦГА АГА

иРНК: УЦГ ЦГГ АГУ ГЦУ УЦУ

ДНК1: АГЦ ГЦЦ ТЦА ЦГА АГА

ДНК2: ТЦГ ЦГГ АГТ ГЦТ ТЦТ

Задание №50.

При скрещивании пестрой хохлатой (В) курицы с таким же петухом было получено восемь цыплят: четыре цыпленка пестрых хохлатых, два - белых (а) хохлатых и два - черных хохлатых. Составьте схему решения задачи. Определите генотипы родителей и потомства, объясните характер наследования признаков и появление особей с пестрой окраской. Какие законы наследственности проявляются в данном случае?

Объяснение: такое расщепление возможно только если родители гетерозиготны по окраске, то есть пестрая окраска имеет генотип - Аа

АА - черная окраска

аа - белая окраска

Аа - пестрая окраска

P: АаВВ х АаВВ

G: АВ, аВ

F1: АаВВ - пестрый хохлатый (4 цыпленка)

ааВВ - белый хохлатый (два цыпленка)

ААВВ - черный хохлатый

По окраске расщепление по генотипу и фенотипу одинаковое: 1:2:1, так как здесь присутствует явление неполного доминирования (между и черной и белой окраской появляется промежуточный вариант), признаки наследуются независимо.